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題名 | 利用果蠅細胞表現牛傳染性鼻氣管炎病毒DNA-尿嘧啶醣甘酵素=Expression of the Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus(IBRV) - Encoded Uracil-DNA Glycosylase in Cultured Drosophila Cells |
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作者 | 鍾楊聰; | 書刊名 | 中華民國獸醫學會雜誌 |
卷期 | 25:3 1999.09[民88.09] |
頁次 | 頁199-209 |
分類號 | 437.246 |
關鍵詞 | 牛傳染性鼻氣管炎病毒; DNA-尿嘧啶醣甘酵素; 果蠅表現系統; Infectious bovine rhinotracheitis; Uracil-DNA glycosylase; Drosophila expression system; |
語文 | 中文(Chinese) |
中文摘要 | 尿嘧啶-DNA醣甘酵素(uracil-DNA glycosylase; UDGase)可藉由水解單股或雙股 DNA 中的尿嘧啶醣甘鍵(uracil-glycosidic bonds)而移除DNA中之尿嘧啶殘基。此酵素在重組DNA技術上之應用性日廣,已成為一項重要的DNA操作工具。先前我們曾經自牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus; IBRV)中分離出其UDGase (UL2)基因,並將之轉送入大腸桿菌細胞中進行重組基因之表現。可惜大多數重組基因之產物形成包涵體(inclusion body),真正具有UDGase酵素活性的可溶性蛋白質的產量並不高。為了獲取足量之IBRV UDGase以供進一步解析其分子結構與功能之用,以及評估新近商品化之果蠅表現系統(Drosophila expression system)的可用性,在本研究中我嘗試使用新型表現載體pAc5.1/V5-His,配合第二代史奈德細胞(Schneider line 2 cells),進行IBRV UL2基因之短暫表現(transient expression)。西方墨點分析(western blotting)結果顯示,果蠅細胞之蛋白質萃取液中存在有分子量相當於25 kDa的特定蛋白質,和根據IBRV UL2基因之核甘酸序列所推測的大小相符。使用金屬離子親合性層析法(metal affinity chromatography)可以迅速將之純化為均質。酵素活性分析進一步證實此純化得之重組型蛋白質的確具有UDGase功能。 |
英文摘要 | Uracil-DNA glycosylase (UDGase) hydrolyzes uracil-glycosidic bonds in single- or double-stranded DNA excising uracil and creating alkaline sensitive abasic sites in the DNA. In recent years, this enzyme has been widely used in recombinant DNA technology and become an important tool of DNA manipulation. We previously cloned the UDGase (UL2) gene from infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV) and expressed it in Escherichia coli. It was found that only a small amount of the gene products displays UDGase activity, while others form insoluble inclusion bodies with no biological function. In the present study, I adopted a newly commercialized expression vector, pAc5.1/V5-His, to carry out transient expression of the IBRV UDGase gene in cultured Drosophila Schneider line 2 cells. The result of western blot analysis showed the presence of a specific 25 kDa protein in cellular extracts of those transfected cells. A column chromatographic procedure using metal affinity resins resulted in homogenous preparation of the protein. Subsequent enzymatic assay verified that the purified protein does have UDGase activity. |
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